产品名称：YO425 SE（YO425 琥珀酰亚胺酯）

产品规格：1mg

储存条件：-20℃避光保存，有效期见外包装

产品介绍:
本公司提供多种性价比高的氨基反应染料，用于标记蛋白质和其他含胺化合物。YO Dye SE可以与氨基基团反应生成稳定的酰胺键。

使用方法:

1. 实验材料

（1）蛋白溶液不可含有能与染料反应的胺类化学物质，如氨基酸、Tris、BSA、明胶等。如果蛋白中含有此类化学物质，应用 pH~7.4 的 PBS 缓冲液预先透析处理。低浓度 (< 3 mM) 叠氮化钠的存在不会产生干扰与标记反应。

（2）溶液 A：PBS 缓冲液（pH 7.4）。

（3）溶液 B：0.2 M NaHCO3 溶液，用 2 M NaOH 将 pH 值调至 9.0。

（4）溶液 C：向 20 份溶液 A 中加入 1 份溶液 B，得到 pH 8.3 的标记缓冲液。保存在密封瓶中，该溶液可长期保持稳定。

（5）Sephadex G-25 凝胶过滤柱。

2. 标记方法和步骤

（1）将 1~5 mg 蛋白溶解在 1 mL 溶液 C 中。

（2）将 1 mg 染料溶解在 50–200 μL 无水、不含胺的 DMSO 中，充分震荡混匀。

（3）取适当体积的染料加入蛋白质溶液中，使染料/蛋白的摩尔比在 3: 1，由于蛋白质和标记试剂的不同反应性，可能会发生变化。这可能需要优化反应中使用的染料与蛋白质的比例，以获得所需的 DOL。

（4）室温孵育 1 h。对于 YO565 SE 建议孵育 18 h 以完成标记反应。

（5）用溶液 A 平衡葡聚糖凝胶 G-25 透析柱。

（6）将步骤（4）反应溶液加入柱子，并用溶液 A 洗脱。首先洗脱出来的着色带是染料-蛋白结合物。注：为防止洗脱后偶联物发生变性，可添加牛血清白蛋白 (BSA) 或其他稳定剂。 3. DOL 计算 DOL = c (dye) /c (protein) = (Amax/εmax) / (Apro/εpro) = (Amax · εpro) / [(A280 – Amax·Cf)·εmax] a. εpro 为蛋白的摩尔吸光系数； b. A280和 Amax分别是指在 280 nm 处的吸光度以及在 吸收波长处的吸光度； c. Cf是校正因子，参考上面表格； d. εmax为染料的摩尔吸光系数。

注意事项:
1. 荧光染料激发与发射波长会受到溶剂的影响，使用不同溶剂，则激发与发射波长可能会发生变化。
2. 标记的蛋白如需储存，可以添加终浓度为2 mM NaN3作为防腐剂，放置于4℃避光保存。如需长期储存，请将溶液分成小份并在 -20℃ 下冷冻，避免反复冻融，尽可能保护染料偶联物免受光照。
3. 操作过程注意避光，避免产生气泡。
4. 层析柱装柱时，尽量使柱体均匀，柱面平整，无气泡、裂隙。
5. 上样时注意，当柱顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品，洗脱时，当样品走至与凝胶平面相切时再加洗脱液。
6. 影响标记效率的其他因素还包括：温度、反应时间、pH、荧光染料与蛋白的量等，需注意控制。
7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套。