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猪轮状病毒(PRV)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
  • 品牌:YLKbio
  • 产地:国产/进口
  • 型号:50T/盒
  • 货号:YLK-PCR0364
  • 价格: ¥2800/盒
  • 发布日期: 2024-06-12
  • 更新日期: 2024-12-05
产品详请
产地 国产/进口
品牌 YLKbio
货号 YLK-PCR0364
用途 科研
包装规格 50T/盒
是否进口
【产品名称】
商品名称:猪轮状病毒(PRV)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
Name :Porcine Rotavirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】25T/盒、50T/盒
【预期用途】
猪轮状病毒病是由猪轮状病毒感染引起的以急/性/腹/泻为特征的急性肠道传染病,临/床/上以水样腹/泻,呕吐,嗜/睡脱水,厌/食,迅速消/瘦为主要特点,目前尚无 药物进行针对性 ,疫苗免疫效果也参差不齐,   给养猪业带来严重的经济损失。猪轮状病毒 A 型是引起仔猪(包括断奶前后的)腹/泻最常见的亚型,在由猪轮状病毒引起商品化猪群的所有腹/泻病中占 90%以上。
本试剂盒适用于检测猪临床样品(猪小肠和新鲜粪便)或细胞培养物中猪轮状病毒的 RNA,适用于猪轮状病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,设计一对猪轮状病毒特异性引物,结合一条特异性探针,用荧光 PCR 技术对猪轮状病毒的 RNA 进行体外扩增检测,用于临/床/上对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 25T/盒 50T/盒
PRV 反应液 500μL×1 管 500μL×2 管
酶液 25μL×1 管 50μL×1 管
PRV 阳性质控品 50μL ×1 管 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管 250μL ×1 管
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
采集腹/泻急性期的小肠(5.0cm~10.0cm)或新鲜粪便(5.0g~10.0g),放到密封袋中,置于带有冰袋的保   存箱中,送至实验室[1]。
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存,应放置-70℃以下保存,冻融不超过 3 次。
【使用方法】
1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理
小肠样品:取 5.0cm~10.0cm 小肠组织,用剪刀剪碎,加入 10mL PBS,用适宜规格的组织研磨器或研钵研磨后转移到适宜玻璃瓶中,每毫升样品加入 RNA 酶抑制剂 RRI(40U/μL)500μL,-20℃反复冻融 3 次后,摇匀,取 1.0mL 到 1.5mL 离心管中,经 12000 r/min 离心 5min,取 500μL 上清备用。
粪便样品:取 0.5g~1.0g 新鲜粪便,加入到含 5.0mL~10.0mL 样品处理液(配方参考 GB/T 34756-2017 猪轮状病毒病病毒 RT-PCR 检测方法的规范性附录 A.2)的玻璃瓶中,每毫升样品加入 RNA 酶抑制剂 RRI(40 U/μL)500μL,-20℃反复冻融 3 次后,摇匀,取 1.0mL 到 1.5 mL 离心管中,经 12000 r/min 离心 5min,取500μL 上清液备用。
细胞培养物样本:取细胞培养物,每毫升样品加入 RNA 酶抑制剂 RRI(40 U/μL)500μL,反复冻融 3 次, 经 2000 r/min 离心 10min,取 1mL 上清备用[ 1]。
1.2 核酸提取
推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取,   请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 PRV 反应液 酶液
用量(样本数为 N) 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,20μL/管。
3. 加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀, 短暂离心。
4. PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM,淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光,选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置:
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 50℃ 10min 否
2 1 cycle 95℃ 2min 否
3 45cycles 95℃ 15sec 否
60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定(请参照各仪器使用说明书进行设置,以分析 ABI7500 仪器为例)
反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用户可根据实际情况自行调整,Start 值可设在 3~15、End 值可设在 5~20,使阈值线位于扩增曲线指数期,阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线),点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤40,且曲线有明显的指数增长曲线; 阴性:样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品:无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示;阳性质控品:扩增曲线有明显指数增长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
3. 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
5. 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
6. 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
7. 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行;
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
3. 反应液应避光保存;
4. 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7. 实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器;
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1] 国家市场监督管理总局. GB/T 34756-2017 猪轮状病毒病病毒 RT-PCR 检测方法[S].
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