产品名称：YF® 594-3-dUTP（YF® 594-3标记dUTP）

产品规格：25 nmole

储存条件：-20℃避光保存，有效期见外包装。可以采用pH7.4的10 mM Tris溶解后，分装保存，避免反复冻融。

使用方法：

DNA 标记 

1. 试剂（自备）（1）Taq DNA 聚合酶（2）10× Taq reaction buffer （3）25 mM MgCl2 （4）dATP, dTTP, dCTP, dGTP (单独溶液), 1 mM each （5）DNA 模板（6）正向、反向引物，10 μM each （7）PCR 清洁试剂盒 

2. PCR 反应

（1）先按照表 1 反应体系配制 PCR 反应混合液

（2）再在每个反应管加 1μL 1mM YF® dye dUTP 染料注：阴性对照管，加 1 μL 1mM dTTP 代替 YF® dye dUTP 

（3）按照表 2 程序运行 PCR 反应注：a. 热变性时间依据不同的 Taq 酶进行调整； b. 退火温度设置：Tm - 5℃； c. 延伸时间根据扩增片段大小而定，一般 200 - 300 bp 片段设为 1 min 即可。

（4）可选步骤。用 PCR 清洁试剂盒去除未掺入的单核苷酸。

（5）取 10%的 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳（凝胶不加入 DNA 染料），检测 PCR 反应的效率和特异性，通过紫外凝胶成像仪或激光凝胶扫描仪观察。其中远红外染料（波长 ≥650 nm），肉眼无法观察。注：凝胶染色前先观察 YF®染料的荧光，以免与下一步的凝胶染料发生荧光淬灭。

 (6) 采用后染法，使用 DNA 凝胶染料对凝胶进行染色，观察总的 PCR 产物或阴性对照组的 PCR 扩增产物。 TUNEL 法检测细胞凋亡注：我司提供了一系列 YF® Dye TUNEL Assay Kits，试剂盒组分包括：平衡缓冲液、反应缓冲液和 TdT 酶等。 

1. 试剂（自备）

（1）PBS, pH 7.4 

（2）4%甲醛 in PBS 

（3）70%乙醇（可选）

（4）0.2% Triton™ X - 100 in PBS 

（5）0.1% Triton™ X - 100 in PBS/5 mg/mL bovine serum albumin (BSA) 

（6）12.5 U/μL 末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (TdT) 

（7）5×TdT 反应缓冲液：1M 二甲基胂酸钾，125 mM TrisHCl，1.25 mg/mL BSA，pH 6.6 

（8）25 mM CoCl2 溶液

（9）100 μM dATP 

2. 样品准备

（1）细胞或新鲜冷冻组织切片的准备 a. 准备一份不含 TdT 酶的样品作为阴性对照。（可选步骤） b. 用 PBS 清洗细胞或者组织切片两次。 c. 向上述细胞或组织切片中加入4%甲醛，4℃孵育30 min。 d. 用 70%乙醇重悬细胞，-20℃可储存两周。（可选步骤） e. 用 PBS 清洗两次。 f. 促渗加入适量的 0.2% Triton X - 100 的 PBS 溶液，室温孵育 30 min。 g. 用 PBS 清洗两次。

（2）石蜡组织切片的准备 a. 准备一份不含 TdT 酶的样品做阴性对照（可选）。 b. 根据标准步骤进行脱蜡或水化处理。 c. 用 PBS 清洗两次。d. 用 20 μg/mL 蛋白酶 K（in PBS）促渗，处理组织，37℃ 孵育 30 min。根据组织类型，蛋白酶 K 的孵育温度和时间可相应的变化。 e. 用 PBS 清洗两次。 

3. 反应混合液准备

（1）用去离子水将 YF® dye dUTP 稀释成 10 μM。

（2）每个样品准备 100 μL TUNEL 平衡缓冲液，配比如下： 20 μL 5×TdT 反应缓冲液； 20 μL 25 mM CoCl2； 60 μL dH2O。

  (3) 每个样品准备 50 μL TUNEL 反应混合液

4. TUNEL 染色

（1）向样品中加入 100 μL 平衡缓冲液，室温下孵育 5 min。注：对于贴壁细胞或者组织切片，用石蜡盖玻片覆盖样品，使缓冲液均匀覆盖样品。（2）去除平衡缓冲液，另外加入 50 μL 反应缓冲液。注：对于贴壁细胞或者组织切片，用盖玻片覆盖样品，使缓冲液均匀覆盖组织。

（3）37℃避光孵育 60 min。组织切片需 37℃避光孵育 2 h。注：a. 对于细胞或组织切片，孵育需在潮湿环境下进行； b. 对于悬浮细胞，孵育需在摇床上进行，或者在孵育的过程中，每隔 15 min，轻轻的摇晃一下反应液。

（4）用含有 0.1% Triton X - 100，5 mg/mL BSA 的 PBS 溶液清洗样品三次，每次 5 min。

（5）如果需要，可进行样品复染。采用荧光显微镜或者流式细胞仪观察。TUNEL 标记的细胞的细胞核显示出明亮的荧光。不含 TdT 酶的对照组可观察到细胞未被标记上荧光。