产品名称：JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒

产品规格：20T/100T

储存条件：-20℃避光冷藏，其中B组份也可4℃保存。为避免反复冻融，A与C组份建议分装。有效期见外包装。

产品介绍：

线粒体膜电位降低是细胞早期凋亡的一个标志，它发生在细胞膜上的磷酯酰丝氨酸外翻与Caspase水解酶激活之前。当线粒体膜通透性发生改变时，膜电位会降低。这种膜电位的改变是由于Bax二聚体的形成和 Bid, Bak, Bad的激活，从而诱导线粒体膜形成孔隙造成的。当这些促凋亡蛋白被激活时，线粒体同时也将细胞色素C释放到细胞质中。
JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△ Ψm的理想荧光探针，它可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
JC-1单体的 激发波长为510 nm， 发射波长为527 nm；JC-1 聚合物的 激发波长为585 nm， 发射波长为590 nm。本试剂盒操作简单快速，可以通过流式细胞仪，荧光显微镜或荧光酶标仪进行检测，同时提供了CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。

产品内容：

使用方法:

1. 试剂准备配制 JC-1 工作液按如下方案配置 1 mL 1×JC-1 染色工作液：取 10 μL 100×JC-1 染色液，加入到 890 μL 灭菌的 diH2O 中，涡旋混匀，向上述混合液中加入 100 μL 10× Assay Buffer，涡旋混匀，即可得到 1×JC-1 染色液。注：①配置体积可同比例扩大或缩小。 ②不建议直接用 1×Assay Buffer 稀释 100×JC-1 染色液，可能会出现沉淀。

配制 1× Assay Buffer 按照 10×assay buffer ：diH2O = 1 : 9 的比例配置 1×assay buffer，如 1 mL 10×assay buffer + 9 mL diH2O。 

2. 细胞染色开始实验之前，请确保 JC-1 和 CCCP 溶液已恢复至室温。

（1）按实验所需，在培养板中接种细胞（悬浮细胞不要超过 10 6个/mL）。

（2）阳性对照组：把试剂盒中提供的 CCCP (50 mM)推荐按照 1:1000 的比例加入到细胞培养液中（如终浓度为 50 μM 即 1 μL 50 mM 的 CCCP 溶液加入至 1 mL 细胞培养液中），37℃孵育 20 min。对于特定的细胞，CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。对于悬浮细胞：

（3）取 5×10 5个细胞，重悬于 0.5 mL 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

（4）加入 0.5 mL JC-1 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20 min。

（5）孵育结束后，1000 rpm 离心 5 min，弃上清（注意尽量不要吸除细胞）。

（6）加入 1 mL 预冷的 1×Assay Buffer 重悬细胞，1000 rpm 离心 5 min，离心去除上清，重复一次。

（7）再用适量预冷的 1× Assay Buffer 重悬，用荧光显微镜观察，也可以用流式细胞仪分析。对于贴壁细胞：注意：对于贴壁细胞，如果希望采用流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。以下为贴壁细胞对于荧光显微镜或荧光酶标仪的检测流程。

（八）对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用 PBS 或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入 1mL 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

（九）加入 1 mL JC-1 染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20 min。

（十）孵育结束后，吸除上清，加入 1 mL 预冷的 1×Assay Buffer，吸除上清，重复一次。

（十一）加入 2 mL 细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红，用荧光显微镜下观察，也可以用荧光酶标仪检测。 

3. 结果分析

（1）流式细胞仪分析对于正常细胞，在 PE 或 PI（FL2）通道可以检测到线粒体内的 JC-1 红色聚集物；对于凋亡细胞，在 FITC（FL1）通道可以检测到 JC-1 绿色单体物。

（2）荧光显微镜分析 a．采用可以同时检测荧光素和罗丹明，或者荧光素与 Texas Red 的双通道滤波器荧光显微镜观察细胞。 b．对于正常细胞，拥有完整的线粒体膜电位，线粒体在 590 nm 处发出红色荧光；对于凋亡或坏死的细胞，染料以单体形式存在，在 530 nm 处发出绿色荧光。

（3）荧光酶标仪分析 a. 红色荧光：Ex/Em=550/600 nm；绿色荧光 Ex/Em=485/535 nm。 b．计算红绿荧光比值。 c．与正常细胞相比，在凋亡或坏死细胞中，红绿荧光比值会降低。

注意事项：

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。 

2. JC-1(100× in DMSO)在较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以 20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。 

3. 配制 JC-1 染色工作液时，必须先把试剂盒提供的 JC-1(100× in DMSO)用灭菌 diH2O 充分溶解混匀后，才可以加入 10× Assay Buffer。不可先配制 1× Assay Buffer 再加入 JC-1(100× in DMSO)，这样 JC-1 会很难充分溶解，会严重影响后续的检测。 

4. JC-1 染色完成后用 1× Assay Buffer 洗涤时，使 1× Assay Buffer 保持 4℃左右，此时的洗涤效果较好。 

5. JC-1 染色并洗涤完成后尽量在 30 分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。 

6. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。 

7. 本产品 于科研，不得用于临床诊断或 ，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。 

8. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。