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产地 | 国产 |
品牌 | YLKbio |
货号 | YLK-U0020 |
用途 | 科研&细胞凋亡检测 |
包装规格 | 20T/100T |
是否进口 | 否 |
产品名称:JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒
产品规格:20T/100T
储存条件:-20℃避光冷藏,其中B组份也可4℃保存。为避免反复冻融,A与C组份建议分装。有效期见外包装。
产品介绍:
线粒体膜电位降低是细胞早期凋亡的一个标志,它发生在细胞膜上的磷酯酰丝氨酸外翻与Caspase水解酶激活之前。当线粒体膜通透性发生改变时,膜电位会降低。这种膜电位的改变是由于Bax二聚体的形成和 Bid, Bak, Bad的激活,从而诱导线粒体膜形成孔隙造成的。当这些促凋亡蛋白被激活时,线粒体同时也将细胞色素C释放到细胞质中。
JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△ Ψm的理想荧光探针,它可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时,JC-1聚集在线粒体的基质中,形成聚合物,产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体,可以产生绿色荧光。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到膜电位的下降,同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
JC-1单体的 激发波长为510 nm, 发射波长为527 nm;JC-1 聚合物的 激发波长为585 nm, 发射波长为590 nm。本试剂盒操作简单快速,可以通过流式细胞仪,荧光显微镜或荧光酶标仪进行检测,同时提供了CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。
产品内容:
组分 |
20T | 100T |
A: JC-1, 100× in DMSO |
100 μL |
500 μL |
B: 10× Assay Buffer |
5 mL |
25 mL |
C: CCCP, 50 mM |
10 μL |
50 μL |
使用方法:
1. 试剂准备配制 JC-1 工作液按如下方案配置 1 mL 1×JC-1 染色工作液:取 10 μL 100×JC-1 染色液,加入到 890 μL 灭菌的 diH2O 中,涡旋混匀,向上述混合液中加入 100 μL 10× Assay Buffer,涡旋混匀,即可得到 1×JC-1 染色液。注:①配置体积可同比例扩大或缩小。 ②不建议直接用 1×Assay Buffer 稀释 100×JC-1 染色液,可能会出现沉淀。
配制 1× Assay Buffer 按照 10×assay buffer :diH2O = 1 : 9 的比例配置 1×assay buffer,如 1 mL 10×assay buffer + 9 mL diH2O。
2. 细胞染色开始实验之前,请确保 JC-1 和 CCCP 溶液已恢复至室温。
(1)按实验所需,在培养板中接种细胞(悬浮细胞不要超过 10 6个/mL)。
(2)阳性对照组:把试剂盒中提供的 CCCP (50 mM)推荐按照 1:1000 的比例加入到细胞培养液中(如终浓度为 50 μM 即 1 μL 50 mM 的 CCCP 溶液加入至 1 mL 细胞培养液中),37℃孵育 20 min。对于特定的细胞,CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同,需自行参考相关文献资料确定。对于悬浮细胞:
(3)取 5×10 5个细胞,重悬于 0.5 mL 细胞培养液中,细胞培养液中可以含血清和酚红。
(4)加入 0.5 mL JC-1 染色工作液,颠倒数次混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20 min。
(5)孵育结束后,1000 rpm 离心 5 min,弃上清(注意尽量不要吸除细胞)。
(6)加入 1 mL 预冷的 1×Assay Buffer 重悬细胞,1000 rpm 离心 5 min,离心去除上清,重复一次。
(7)再用适量预冷的 1× Assay Buffer 重悬,用荧光显微镜观察,也可以用流式细胞仪分析。对于贴壁细胞:注意:对于贴壁细胞,如果希望采用流式细胞仪检测,可以先收集细胞,重悬后参考悬浮细胞的检测方法。以下为贴壁细胞对于荧光显微镜或荧光酶标仪的检测流程。
(八)对于六孔板的一个孔,吸除培养液,根据具体实验如有必要可以用 PBS 或其它适当溶液洗涤细胞一次,加入 1mL 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
(九)加入 1 mL JC-1 染色工作液,充分混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20 min。
(十)孵育结束后,吸除上清,加入 1 mL 预冷的 1×Assay Buffer,吸除上清,重复一次。
(十一)加入 2 mL 细胞培养液,培养液中可以含有血清和酚红,用荧光显微镜下观察,也可以用荧光酶标仪检测。
3. 结果分析
(1)流式细胞仪分析对于正常细胞,在 PE 或 PI(FL2)通道可以检测到线粒体内的 JC-1 红色聚集物;对于凋亡细胞,在 FITC(FL1)通道可以检测到 JC-1 绿色单体物。
(2)荧光显微镜分析 a.采用可以同时检测荧光素和罗丹明,或者荧光素与 Texas Red 的双通道滤波器荧光显微镜观察细胞。 b.对于正常细胞,拥有完整的线粒体膜电位,线粒体在 590 nm 处发出红色荧光;对于凋亡或坏死的细胞,染料以单体形式存在,在 530 nm 处发出绿色荧光。
(3)荧光酶标仪分析 a. 红色荧光:Ex/Em=550/600 nm;绿色荧光 Ex/Em=485/535 nm。 b.计算红绿荧光比值。 c.与正常细胞相比,在凋亡或坏死细胞中,红绿荧光比值会降低。
注意事项:
1. 使用前请将产品瞬时离心至管底,再进行后续实验。
2. JC-1(100× in DMSO)在较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内,可以 20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
3. 配制 JC-1 染色工作液时,必须先把试剂盒提供的 JC-1(100× in DMSO)用灭菌 diH2O 充分溶解混匀后,才可以加入 10× Assay Buffer。不可先配制 1× Assay Buffer 再加入 JC-1(100× in DMSO),这样 JC-1 会很难充分溶解,会严重影响后续的检测。
4. JC-1 染色完成后用 1× Assay Buffer 洗涤时,使 1× Assay Buffer 保持 4℃左右,此时的洗涤效果较好。
5. JC-1 染色并洗涤完成后尽量在 30 分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。
6. 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
7. 本产品 于科研,不得用于临床诊断或 ,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
8. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。