产品名称：YF® 555 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（橙红色荧光）

产品规格：2-20T/10-100T/50-500T

储存条件：-20℃避光保存，有效期见外包装。开封后，保存温度详见说明书。

产品规格：

产品内容：

规格：如果用于荧光显微镜检测，所能使用次数为上述各个规格的 使用次数（针对 96 孔板培养的细胞），如 C6043S 可检测 20 个孔的样品（不同容器的具体用量可参考附表 1）；如果用于流式检测，所能使用次数为上述各个规格的最小使用次数，如 C6043S 可检测 2 个样品。

荧光光谱数据：YF® 488 Azide：495/519 nm；YF® 555 Azide：555/565 nm；YF®594 Azide：590/617 nm YF® 647A Azide：650/670 nm；Hoechst 33342：350/461 nm（bound to DNA）

产品介绍：

细胞增殖检测是评估细胞健康程度、遗传毒性及抗-肿-瘤-药物效果的基础实验手段。检测细胞增殖最 的方法是 BrdU法。EdU法检测试剂盒是BrdU法的革命性突破。EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）是一种嘧啶类似物，在DNA合成期整合入DNA双链。EdU法检测基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃作用发生共价反应，形成共价键。本试剂盒中，EdU含有炔烃，YF® 488/555/594/647A Azide染料含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有效，易于使用。BrdU方法需要DNA变性（如酸变性、热变性或者用DNase消化）暴露出BrdU，从而方便BrdU抗体结合；而EdU法只需多聚甲醛固定和Triton X-100促渗就可以使检测试剂进入细胞，只需少量的叠氮化染料即可非常有效地标记出整合的EdU。本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组分，可以用于体外培养细胞的增殖检测。

使用方法实验材料（自备）

? 10 mM PBS, pH 7.2-7.6

? 4 %多聚甲醛固定液（in PBS）

? 促渗试剂（0.5 %Triton X-100 in PBS）

? 2 mg/mL 甘氨酸溶液（in ddH2O）

? 3 %BSA in PBS, pH 7.2-7.6

? 1 % BSA in PBS, pH 7.2-7.6

? ddH2O

? 96/24/12/6 孔培养板或培养皿

荧光显微镜检测方法

1. 细胞培养取对数生长期细胞，以每孔4×103 -1×105细胞（可根据细胞大小、生长速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密度）接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。

2. 药物处理根据实验需要进行各种药物处理。

3. EdU标记

（1）用细胞完全培养基按一定比例稀释 EdU 溶液（组分 A）至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加 EdU 处理的阴性对照组。注：EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以 10 μM 的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置 EdU 浓度梯度，可参考附表 2 和附表 3。

（2）细胞培养箱中孵育 2 h。注： 孵育时间与细胞周期有关，大多数肿-瘤细胞系均可采用 2 h 的孵育时间，可参考附表 2。EdU 浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2 h）宜采用高浓度，如：10~50 μM；长时间孵育（>24 h）宜采用低浓度，如：1~10 μM；也可参考附表 3。

4. 细胞固定及促渗注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成 EdU 孵育后，以含 3% BSA 洗涤液洗涤细胞 2 次，在细胞固定促渗之前进行。

（1）孵育完成后，去除培养基。以 1X PBS 清洗细胞两次，每次5 min，以除去未掺入 DNA 的 EdU 残留，贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。加入50 μL 4 % 多聚甲醛固定液，室温孵育20 min后，去除固定液。

（2）每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室温孵育5 min，中和残留的固定液。

（3）以每孔100 μL 3 % BSA洗涤细胞2次。

（4）去除洗涤液，加入100 μL 0.5 % Triton X-100，室温孵育10 min。

5. EdU检测注：本参考步骤每个样本使用100 μL的工作液，用户可以根据自己的样本情况调整用量。

（1）配置1× Click-iT EdU反应缓冲液（组分C）：用ddH2O将组分C稀释10倍。

（2）配置5× Click-iT EdU缓冲液添加物（组分E）：加300 μL的ddH2O至30 mg的E组分管中（终浓度100 mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。注：不同规格的组分E均按照此比例加ddH2O溶解，制备成5× 储液备用。

（3）准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物：用ddH2O稀释5× Click-iT EdU缓冲液添加物至1×，溶液应现配现用。

（4）依据表 1 准备 Click-iT 工作液。

（5）去除促渗剂，每孔100 μL的3% BSA洗涤液洗涤2次。

（6）每孔加入100 μL Click-iT工作液，均匀覆盖细胞。

（7）室温避光孵育 30 min。

（8）除去 Click-iT 工作液，以 100 μL 3% BSA 洗涤细胞 2 次后，去除洗涤液, 加入 100 μL PBS 保持细胞湿润。如其他无特别要求，即可进行拍照分析。

6. DNA 复染（可选）

（1）用 100 μL PBS 洗涤细胞 1 次，去除洗涤液。

（2）用 PBS 将 Hoechst 33342（组分 F）稀释 2000 倍。

（3）每孔加 100 μL 1×Hoechst 33342 溶液，室温避光孵育 15-30 min。

（4）去除 Hoechst 33342 溶液，用 100 μL PBS 洗涤细胞 2 次。

7. 成像及分析建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察；如果条件限制，请于 4°C 条件下避光湿润保存 3 天之内完成拍照。流式细胞仪检测方法

1. 细胞培养每孔 1×105~3×106 个细胞接种于6孔板中。

2. 药物处理根据实验需要进行各种药物处理。

3. EdU 标记细胞

（1）用细胞完全培养基按一定比例稀释 EdU 溶液（组分 A）至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加 EdU 处理的阴性对照组。注：EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以 10 μM 的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置 EdU 浓度梯度，可参考附表 2 和附表 3。

（2）细胞培养箱中孵育 2 h。EdU 孵育细胞的时间可以直接用作测定细胞 DNA 合成的指标，时间点选择以及孵育的时间取决于细胞生长速率。通过短暂的 EdU 孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。注： 孵育时间与细胞周期有关，大多数肿-瘤细胞系均可采用 2 h 的孵育时间，可参考附表 2。EdU 浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2 h）宜采用高浓度，如：10~50 μM；长时间孵育（>24 h）宜采用低浓度，如：1~10 μM；也可参考附表 3。

4. 细胞固定及促渗注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成 EdU 孵育后，以含 1 % BSA 洗涤细胞 2 次，在细胞固定促渗之前进行。

（1）孵育完成后，收集细胞，每管加入1 mL PBS 清洗细胞，1000 rpm离心5 min，吸弃上清，以除去未掺入 DNA的 EdU 残留。

（2）每管加入 1 mL 4 % 多聚甲醛固定液重悬细胞。

（3）室温孵育 20 min，1000 rpm 离心 5 min ，吸弃上清。

（4）每管加入 1 mL 2 mg/mL 甘氨酸孵育 5min，中和残留的固定液，1000 rpm 离心 5 min，吸弃上清，每管加入 1 mL PBS 清洗 1 次，1000 rpm 离心 5 min，吸弃上清。

（5）每管加入 1mL 0.5 % Triton X-100 促渗液重悬细胞，室温孵育 10 min。

5. EdU 检测注：针对 6 孔板样本可参考每孔 1 mL 的工作液来进行，用户可以根据自己的样本情况调整用量。

（1）配置1× Click-iT EdU反应缓冲液：用ddH2O将组分C稀释10倍。

（2）配置 5× Click-iT EdU 缓冲液添加物（组分 E）：加 300 μL ddH2O 至 30 mg 的组分 E 试管中（终浓度 100 mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。注：不同规格的组分 E 均按照此比例加 ddH2O 溶解为 5× 储液备用。

（3）准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物：以ddH2O稀释5× Click-iT EdU缓冲液添加物储液至1×，溶液应现配现用。

（4）依据表 2 准备 Click-iT 工作液。

（5）1000 rpm 离 5 min，吸弃上清，去除促渗剂，每管加入 1mL 的 1% BSA 洗涤液洗涤 2 次，1000 rpm 离 5 min，吸弃上清。

（6）每管加入 1 mL Click-iT 工作液，混匀。

（7）室温避光孵育 30 min。（8）1000 rpm 离 5 min，吸弃染色反应液，每管加入 1% BSA 洗涤细胞 2 次，1000 rpm 离心 5min，吸弃上清，用 1 mL 1 % BSA 再次重悬细胞（重悬细胞的溶液体积可根据细胞的数量加以调整），流式细胞仪检测。注：如需进行其他标志物检测可参考步骤 4。 6. 细胞内抗原标记（可选步骤）

（1）加入抗体工作液，混匀。

（2）避光条件下，以合适的温度及时间孵育抗体。

7. 流式检测及分析:

（1）建议染色完成后立即进行流式检测；如果条件限制，请避光 4℃湿润保存待测，但不应超过 3 天。

（2）检测的细胞数量建议尽量能达到 ，若细胞数量较少，检测的细胞数量可调整为十万级起始进行实验。对于细胞得率过少（刚到万级）的情况，可能不利于做流式图，对此可适当减少步骤 5（8）中的清洗次数。

注意事项

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 荧光染料均存在淬灭问题，实验操作时请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

3. Click-iT EdU 缓冲液添加物溶液 现配现用，以保证 结果。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本产品仅供科研。

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