【产品名称】
商品名称：乙-型-肝-炎病毒cccDNA探针法qPCR试剂盒（不含内参）
【包装规格】50T/盒
【产品简介及特点】乙-型-肝-炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）属嗜肝 DNA 病毒科正嗜肝 DNA 病毒属，基因组长约 3.2 kb，为部分双链环状 DNA 病毒。乙-型-肝-炎病毒 cccDNA 是乙-肝-病毒前基因组 RNA 复制的原始模板，每个肝细胞内只有约 5～50 个拷贝，但对乙-肝-病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，只有清除了细胞核内的 cccDNA，才能彻-底消除乙-肝患者病毒携带状态，达到抗-病-毒治-疗的目标，因此快速检测乙-型-肝-炎病毒 cccDNA 具有重要的意义。本产品就是以探针法 qPCR 技术为基础开发的专门检测乙-型-肝-炎病毒 cccDNA 的试剂盒，它有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到 100 拷贝/反应。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据乙-型-肝-炎病毒 cccDNA 高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA 发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。
6. 本产品足够 50 次 20 μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
7. 本产品只能用于科研。

成分	规格	包装
2×Probe qPCR MasterMix	0.5mL	0.5ml本色管
荧光 PCR 专用模板稀释液	1ml	1.5ml绿盖管
超纯水	1ml	1.5ml蓝盖管
乙-型-肝-炎病毒 cccDNA qPCR 引物-探针干粉	50次	1.5ml棕色管
乙-型-肝-炎病毒 cccDNA qPCR 阳性对照(1E7 拷贝/μL)	50ul	0.5ml黄盖管
使用手册	1份	1份

注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入 165uL 的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

【运输及保存】
低温运输，-20℃保存，保存期限为 24 个月。

【自备试剂】

样品 DNA

【使用方法】

一、稀释标准曲线样品（以 1E1-1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试
剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传-染-性-病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传-染-性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6、5、4、3、2、1。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最-好用带芯枪头，下同）。
3. 在 6 号管中加入 5 μL 1E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，最-好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），
一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10 μL 上步所得 4 号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（直接用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕
后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最-后加）：

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性对照	标准曲线样品管 （1-6 管）
2×Probe qPCR MagicMix	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
乙-型-肝-炎病毒 cccDNA qPCR 引物-探针混合液	各 3 μL	3 μL	各 3 μL
N+2 个待测 DNA 样本	各7μL	不加	不加
超纯水	不加	7μL	不加
第6步所得标准曲线样品稀释液 （1-6 号）	不加	不加	各7μL（2号样到2号管，3号样 到 3 号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 RT-PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	10min
PCR反应 (45个循环)	95℃	15sec
	60℃	30sec(采集FAM通道的荧光信号，淬灭基团为NFQ)

四、数据处理
12. 如果样本制备阳性对照或 PCR 阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行 PCR 扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或 PCR 阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效， 不需要分析数据，需要跟厂家联系。
13. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴， 绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的log 值， 再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无 Ct 或 Ct 大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 40， 否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无 Ct 或 Ct 大于或等于 40，
则为阴性。如果 Ct 小于 40 则为阳性。