【产品名称】
商品名称：蜡样芽孢杆菌非溶血肠毒素B亚基基因探针法qPCR试剂盒（不含内参）
【包装规格】50T/盒
【产品简介及特点】蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus），又称仙人掌杆菌，是一种革兰氏阳性菌，β溶血性的杆状细菌。蜡样芽孢杆菌是引起食-物-中-毒的常见细菌，临床表现有两种类型：呕吐型和腹-泻型。腹-泻型毒素至少由 5 类毒力因子构成:溶血性肠毒素 HBL(hbl)、非溶血性肠毒素 Nhe(nhe，有 A、B、C 三种)、细胞毒素 K(cytK)、肠毒素 T(bceT)以及肠毒素 FM(entFM)。因此快速检测蜡样芽孢杆菌具有重要的意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测蜡样芽孢杆菌 nheB 基因的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到 100 拷贝/μL。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据蜡样芽孢杆菌 DNA nheB 基因高度保守区设计，不会跟其他生物的 DNA 发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。
6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

7. 本产品只能用于科研。

【规格及成分】

成分	规格	包装
2×Probe qPCR MasterMix	0.5mL	0.5ml本色管
荧光 PCR 专用模板稀释液	1ml	1.5ml绿盖管
超纯水	1ml	1.5ml蓝盖管
蜡样芽孢杆菌非溶血肠毒素B亚基基因qPCR引物-探针干粉	150ul	0.5ml棕色管
蜡样芽孢杆菌非溶血肠毒素B亚基基因qPCR阳性对照(1×10E7 拷贝/μL)	50ul	0.5ml黄盖管
使用手册	1份	无

【运输及保存】
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

【自备试剂】

样品 DNA

【使用方法】

一、稀释标准曲线样品（以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能
污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传-染-性-病-原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传-染-性的 DNA 片段作为阳性对照1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最-好用带芯枪头，下同）。
3. 在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用
5. 换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，最-好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性
对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步所得 4 号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC 另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（直接用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设  置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好
后最-后加）：

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性对照	标准曲线样品管 （1-6 管）
2×Probe qPCR MagicMix	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
蜡样芽孢杆菌非溶血肠毒素B亚基基因qPCR 引物-探针混合液	各 3 μL	3 μL	各 3 μL
N+2 个待测 DNA 样本	各7μL	不加	不加
超纯水	不加	7μL	不加
第6步所得标准曲线样品稀释液 （1-6 号）	不加	不加	各7μL（2号样到2号管，3号样 到 3 号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 RT-PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	3min
PCR反应 (40个循环)	95℃	5sec
	60℃	40sec(采集FAM通道的荧光信号，淬灭基团为NFQ)

五、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无 Ct 或者 Ct 大于或等于 35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线， Ct 值应该小于 35，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无 Ct 或者 Ct 大于或等于 35，判为阴性。如果 Ct 小于 35 则为阳性。

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