【产品名称】
商品名称：中国仓鼠细胞逆转录病毒样颗粒探针法qRT-PCR试剂盒（不含内参）
【包装规格】50T/盒
【产品简介及特点】中国仓鼠细胞逆转录病毒样颗粒（Chinese Hamster Ovary Cell Retrovirus-like Particles，简称 CHO-RVLP）的基因组由单链 RNA 组成，长度大约为 8-10knt，具有典型的逆转录病毒结构，包含 gag、pol 和 env 等关键基因，以及可能的调控序列。该病毒样颗粒在生物制药行业中可能引起细胞培养的污染问题。这种污染可能导致中国仓鼠卵巢细胞的异常增殖和转化，影响生物制品的质量和安全性。在经济层面，病毒污染可能导致生产中断、成本增加，甚至产品召回，从而造成重大经济损失。因此，快速检测中国仓鼠卵巢细胞逆转录病毒样颗粒具有重要意义。为此，本公司以探针法 qRT-PCR 技术为基础开发了中国仓鼠细胞逆转录病毒样颗粒的检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到 100 拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据中国仓鼠细胞逆转录病毒样颗粒 RNA 高度保守区设计，不会跟其他生物的 RNA 发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。
6.本产品足够 50 次 20 μL 体系的探针法 qRT-PCR 反应。

7.本产品只能用于科研。

【规格及成分】

成分	规格	包装
探针法qRT-PCR缓冲液	500ul	0.5ml蓝盖管
探针法qRT-PCR酶混合液v2	50ul	0.5ml红盖管
荧光PCR专用模板稀释液	1ml	1.5ml绿盖管
中国仓鼠细胞逆转录病毒样颗粒RT-PCR引物-探针干粉	50次	0.5ml棕色管
中国仓鼠细胞逆转录病毒样颗粒qRT-PCR阳性对照（1E7拷贝/ul）	50ul	0.5ml黄盖管
使用手册	1份	1份

注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入 165 μL 的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

【运输及保存】
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

【自备试剂】

样品 RNA，超纯水，核酸纯化试剂盒。

【使用方法】

一、稀释标准曲线样品（以 1E1-1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传-染-性-病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传-染-性的 DNA 片段作为阳性对照。如果需要 RNA 阳性样品，需要另外订购。
1.标记 6 个离心管，分别为 6、5、4、3、2、1。
2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最-好用带芯枪头，下同）。
3.在 6 号管中加入 5 μL 1E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备
7.如果有 N 个样品，最-好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），
一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10 μL 上步所得第 4 号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次样本制备所要求的起始样本体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8.用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数 RNA 提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、Probe qRT-PCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 RT-PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 RT-PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 RT-PCR 阳性对照（直接用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕
后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最-后加）：

成分	样品管 N+2 个	RT-PCR 阴性对照	标准曲线样品管 （1-6 管）
探针法 qRT-PCR 缓冲液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探针法 qRT-PCR 酶混合液 v2	各 1 μL	1 μL	各 1 μL
中国仓鼠细胞逆转录病毒样颗粒 qRT-PCR 引物-探针混合液	各3μL	3μL	各3μL
N+2个待测RNA样本	各6μL	不加	不加
超纯水	不加	6μL	不加
第6步所得标准曲线样品稀释液 （1-6 号）	不加	不加	各6μL（2号样到2号管，3号样 到 3 号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 qRT-PCR：

过程	温度	时间
逆转录	50℃	10min
预变性	95℃	10min
PCR反应 (40个循环)	95℃	15sec
	60℃	60sec(采集FAM通道的荧光信号，淬灭基团为NFQ)

四、数据处理
12. 如果样本制备阳性对照或 RT-PCR 阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行 RT-PCR 扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或 RT-PCR 阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。
13. 如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须没有读数， 或者大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 40。对待测样品，如果其 Ct 没有读数、大于或等于 40 则均为阴性，如果小于40 则为阳性。