【产品名称】
通用名称：转基因大豆MON87751品系核酸检测试剂盒(荧光PCR法)
Name ：Diagnostic Kit for MON87751 Gene DNA (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
本试剂盒适用于检测转基因植物的 MON87751 基因，用于筛查待检测植物中是否含有 MON87751 成分。其检测结果仅供参考。
【检验原理】
本试剂盒用国家标准的 MON87751 特异性引物和探针，用荧光 PCR 技术进行转基因成分的检测。
【试剂组成】
名 称 规 格
酶液 50μL×1 管
MON87751 反应液 500μL×2 管
MON87751 阳性质控品 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃避光保存、运输、避免反复冻融，反复冻融不能超过 5 次。有效期 12 个月。

【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
称取 200g 样品。
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 0℃冰/壶。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
固体样本：用粉碎机或冷冻研磨仪将样品研磨至细粉状。
1.2 DNA 提取
对于固体标本，DNA 的提取可以采用 SN/T 2584-2010 中推荐的方法：
1) 每个样品取 2 个平行管。称取 200mg 粉碎的样品，加入 1mL 预冷至 4℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静止 5min，4℃条件下 10000g 离心 15min，弃上清液；
2) 加入 600uL 预热至 65℃的裂解液，充分重悬沉淀，在 65℃恒温保持 40min，期间颠倒混匀 5 次；
3) 室温条件下10000g 离心10min，取上清液转移至新离心管中，加入5uLRNAseA， 37℃恒温 30min，分别用等体积苯/酚：异/戊/醇溶液和三/氯/甲/烷：异/戊/醇溶液各抽提一次；
4) 室温条件下，10000g 离心 10min，取上清液至新离心管，加入三分之二体积的异丙/醇，十分之一体积的 3mol/L 的乙/酸钠溶液（pH=6.5），-20℃放置 2-3h；
5) 在 4℃条件下，10000g 离心 15min，弃上清液，用 70%乙/醇洗涤沉淀一次，倒出乙/醇，晾干沉淀；
6) 加入 50uL TE（pH8.0）溶解沉淀，所得溶解即为样品 DNA 溶液。也可使用等效的 DNA 提取试剂盒。
油脂样本请直接选用市售油脂 DNA 提取试剂盒，按说明操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 MON87751 反应液 酶液
用量 20μL 1μL
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；荧光通道选择： 检测通道
（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，请勿选择ROX 参比荧光。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 95℃ 10min 否
2 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道 35
阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
6. 质控标准
阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7. 检测方法的局限性
1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。

【注意事项】
1.所有操作严格按照说明书进行；
2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.反应液应避光保存；
4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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