【产品名称】
商品名称：病/毒/性出血性败/血/症病毒(VHSV)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
Name ：Viral Haemorrhagic Septicemia Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】25T/盒、50T/盒
【预期用途】
病/毒/性出血性败/血/症是一种由病/毒/性出血性败/血/症病毒（VHSV）引起的死亡率极高的疾病，该病毒属于鱼类弹状病毒属。VHSV 包含 3 个血清型，且有 4 个基因型，血清型和基因型之间没有关联。该病最早流行与欧洲大陆，主要对虹鳟鱼、鲆、几种野生海洋鱼类感染。该病在急性感染期表现出明显的临床症/状：病鱼嗜/睡，    皮肤变黑，眼/球/突/出，贫/血，鳍条基部、鳃、眼睛、皮肤出血，游泳异常，腹腔水/肿。病毒的主要传播途径是接触其他被感染的鱼类或受污染的水、污染物或通过食鱼鸟类进行传播[1]。
本试剂盒适用于检测的鱼的脑、肝、肾、脾、腮等组织、雌鱼的卵巢液等标本中病/毒/性出血性败/血/症病毒
RNA，适用于病/毒/性出血性败/血/症病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒对病/毒/性出血性败/血/症病毒基因设计特异性引物和探针[1-3]，用一步法荧光 RT-PCR 技术对病/毒/性出血性败/血/症病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临/床/上对可疑感染病料的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 25T/盒 50T/盒
VHSV 反应液 500μL×1 管 500μL×2 管
酶液 25μL×1 管 50μL×1 管
VHSV 阳性质控品 50μL ×1 管 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管 250μL ×1 管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
对于有临床症/状的鱼，如体长不大于 4cm，取整条鱼，体长 4~6cm 的鱼，取内脏（包括肾）；体长大于 6cm
的鱼则取脑、肝、肾、脾；对于无症/状的鱼，取肾、脾、腮和脑组织，成熟雌鱼还需取卵巢液。
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；卵巢液直接取 100μL。
1.2 核酸提取
推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，   请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 VHSV 反应液 酶液
用量 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：
检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 50℃ 10min 否
2 1 cycle 95℃ 2min 否
3 45 cycles 95℃ 15sec 否
60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1] 国家质量监督检验检疫总局. SN/T 2850-2011 病/毒/性出血性败/血/症检疫技术规范[S]. 北京：科学出版社, 2011.
[2] 倪穗, 余晓巍, 王建平, 等.  应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病/毒/性出血性败/血/症病毒(VHSV)[J].  海洋与湖沼, 2009, 40(4): 489-493.
[3] 安元龙. 病/毒/性出血败/血/症病毒检测方法的建立与应用[J]. 大连工业大学, 2013