【产品名称】

商品名称：猪布氏杆菌(Br.Suis)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name：Brucella suis. Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】25T/盒、50T/盒
【预期用途】
布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌属细/菌/感/染导致人兽共患的传染病,在全 范围内严重威胁人类健康 并影响畜牧业发展。布鲁氏菌属包括羊种布鲁氏菌(B.melitensis),牛种布鲁氏菌(B.abortus)、猪种布鲁氏菌(B.suis)、    绵羊附睾种布鲁氏菌(B.ovis)、犬种布鲁氏菌(B.canis)、沙林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)、鲸种布鲁氏菌(B.ceti)、鳍种布鲁氏菌(B.pinnipedialis)和田鼠种布鲁氏菌(B.microti)及新报道的 B.inopinata,其中猪布病主要是由猪种布鲁氏菌感染猪。其临床主要特征是生殖器官和胎膜发炎，母猪流/产、乳/腺/炎、不育和各种组织(如睾丸、关节)的炎/症。
本试剂盒适用于检测猪血液、猪组织、土壤或物体表面等标本中的布氏杆菌，用于猪布氏杆菌感染的辅助
诊断。
【检验原理】
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对猪布氏杆菌特异性引物，结合一条特异性探针， 用荧光 PCR 技术对猪布氏杆菌的 DNA 进行体外扩增检测，用于临/床/上对可疑感染病料的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 25T/盒 50T/盒
Br.Suis 反应液 500μL×1 管 500μL×2 管
酶液 25μL×1 管 50μL×1 管
Br.Suis 阳性质控品 50μL ×1 管 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管 250μL ×1 管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
猪血液标本：抽取猪静/脉血 3 mL~5 mL 放入带盖的 EDTA 抗凝管中并做好标记送检。
猪组织标本：无菌操作取猪的淋巴结、肝、脾和肾等组织 2 g~5 g，放入无菌容器中，并标记取样日期及部
位。
土壤或粉末状标本：无菌操作用采样勺取 2 g~5 g 标本置于无菌容器中密封保存。
物体表面标本：采用无菌生理盐水湿润的无菌拭子擦拭物体表面(以 100 cm2 为宜)，放入无菌容器中保存。
【保存和运输】
上述标本在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
猪血液标本：无需前处理，可直接用于 DNA 提取。
猪组织标本取 0.25 g 标本,加人 0.5 mL 无菌生理水，匀浆，静置 10 min,取上清液备用。
土壤或粉末状标本：取 0.25 g 标本，加入 0.5 mL 无菌生理盐水，振荡摇匀，静置 10 min，取上清备用。
物体表面标本：采集的标本用 0.5 mL 无菌生理盐水洗涤，振荡摇匀，静置 10 min，取上清液备用。
1.2 核酸提取
推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，   请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满
10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 Br.Suis 反应液 酶液
用量 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；
荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 95℃ 2min 否
2 45 cycles 95℃ 15sec 否
60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存，反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
4. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
5. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
6. 实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；
7. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1] 国家质量监督检验检疫总局. SN/T 1088-2010 布氏杆菌检疫技术规范[S]. 北京:中国标准出版社, 2010.
[2] GB/T 18646-2018, 动物布鲁氏菌病诊断技术[S].