【产品名称】
商品名称：甲型流/感病毒N10亚型(IAV-N10)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)
Name   ：Avian Influenza Virus subtype N10 Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】25T/盒、50T/盒
【预期用途】
甲型流/感病毒（Influenza A virus）为常见流/感病毒，甲型流/感病毒最容易发生变异，甲型流/感病毒的亚型则被人们称为“禽/流/感”，禽/流/感(Bird Flu）是由禽/流/感病毒引起的一种急性传染病，病毒基因变异后能够感染人类， 感染后的症/状主要表现为高热、咳/嗽、流涕、肌/痛等，多数伴有严重的肺/炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。此病可通过消/化/道、呼/吸/道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，人员和车辆往来是传播本病的重要因素。本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理，检测 N10 亚型流/感病毒，对甲型流/感病毒 N10 亚型引起的流/感诊断有重要指导意义。
【检验原理】
本试剂盒针对甲型流/感病毒 N10 亚型 NA 基因高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含甲型流/感病毒 N10 亚型基因组模板的情况下，PCR 反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。
【试剂组成】
包装规格 25T/盒 50T/盒
IAV-N10 反应液 500μL×1 管 500μL×2 管
酶液 25μL×1 管 50μL×1 管
IAV-N10 阳性质控品 50μL ×1 管 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管 250μL ×1 管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
拭子样品：采集咽喉拭子时将拭子每人喉头及上颚裂来回刮 2 次~3 次并旋转，取分泌液；采集泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔至少旋转 3 圈并沾取少量粪便；将采样后的拭子分别放入盛有 1.2 mL 样品稀释液（配制方法见 GB/T 18936-2020 高致病性禽/流/感诊断技术）的 2 mL 采样管中，编号并填写相应采样单。
发/病禽鸟可无菌采集气管、肺、脑、肠（包括内容物）、肝、脾、肾、心等组织脏器，装入 15 mL 或 50 mL
带螺口的有机材料保存管中，编号并填写相应采样单。
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
将棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子；粪便，研碎的组织加 PBS 充分研磨，按照 1g 组织加 10 mL PBS 的比例配成悬液。样品液经 3 000 r/min 离心 10 min，取上清作为核酸检测材料。
1.2 核酸提取
推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取， 请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 IAV-N10 反应液 酶液
用量 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：
检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光， 选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 50℃ 10min 否
2 1 cycle 95℃ 2min 否
3 45 cycles 95℃ 15sec 否
60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。