【产品名称】
犬猫冠状病毒（CFCoV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）
商品名称： 犬猫冠状病毒（CFCoV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）
Name ： Canine coronavirus an feline coronavirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】25T/盒、50T/盒
【预期用途】
犬冠状病毒（Canine coronavirus，CCoV）和猫冠状病毒（feline coronavirus,FCoV）基因组结构相似，均为α 冠状病毒属，单股正链 RNA 病毒。CCoV 和 FCoV 感染主要导致胃肠道病/变，分子流行病学显示，目前这两种病毒在犬群和猫群中传播广泛，对宠物犬猫饲养者、从业爱好者及销售者等危害巨大。
犬冠状病毒感染犬只后主要引起消/化/道系统感染，通常死亡率不高，发/病时表现为呼/吸/急/促、精神不振、食/欲/下/降，之后出现腹/痛、腹/泻，粪便呈水样并具有腥臭味，常伴有便/血。猫冠状病毒主要通过口鼻传播，主要感染幼年和老龄猫。猫冠状病毒主要包括两种：猫肠道冠状病毒（Feline enteric coronavirus,FECV）和猫传/染/性/腹/膜/炎病毒（Feline infectious peritonitis viurs,FIPV）。其中 FECV 的感染仅局限于消/化道，致死率较低；FIPV 为高毒力突变株，致死率高，是目前最常见的致命性猫科病毒，发/病时出现食/欲/下/降、精/神/萎/靡、体态消/瘦和腹/泻的情况，渗出型腹/膜/炎的猫只还会伴有腹腔肿大的情况。
本试剂盒适用于检测犬粪便样本；猫 EDTA 抗凝全血、胸腹水、粪便样本
【检验原理】
本试剂盒根据犬猫冠状病毒基因高度保守区域设计的特异性引物和荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对犬猫冠状病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临/床/上对可疑感染病料的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 25T/盒 50T/盒
CFCoV 反应液 500μL×1 管 500μL×2 管
酶液 25μL×1 管 50μL×1 管
CFCoV 阳性质控品 50μL ×1 管 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管 250μL ×1 管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
血样：压迫猫肘部前臂头静/脉怒张，绷紧头静/脉两侧皮肤，采样针头斜面朝上、呈 15°角由远心端向近心端刺入静/脉/血/管，见有血液回流时，缓慢抽取血液或接入 EDTA 抗凝真空采血/管。
胸腹水：应采用烫烙法消毒采样部位，用灭菌注射器经烫烙部位插入，吸取内部液体病料，然后将病料注入灭菌的试管中。
粪便：一般采集新鲜粪便，或采用棉拭子进行直肠采样或泄殖腔采样。采集肛拭子样品时，取无菌棉拭子插入畜禽肛门或泄殖器腔中，旋转 2 圈~3 圈，刮取直肠黏液或粪便，放入装有 30%甘油磷酸盐缓冲液（配制方法见 NY/T541-2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范）中送检。粪便样品采集后应低温运送至实验室并尽快检测，以防止样品中待检病原死亡、细菌增值或虫卵孵化。
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
将棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子；粪便样本加 PBS 充分混合，按照 1g 组织加 10 mL PBS 的比例配成悬液；将采集的全血加入 EDTA 抗凝剂后充分混合。样品液经 3000r/min 离心 10 min，取上清作为核酸检测材料。
1.2 核酸提取
推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取， 请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 CFCoV 反应液 酶液
用量 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：
检测通道（ReporterDye）FAM，淬灭通道（QuencherDye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光， 选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 50℃ 10min 否
2 1 cycle 95℃ 2min 否
3 45 cycles 95℃ 15sec 否
60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
