【产品名称】
商品名称： 丁型流/感病毒（IDV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）
Name： Influenza D Virus Detection Kit(Real-Time PCR Method)
【包装规格】25T/盒、50T/盒
【预期用途】
流/感病毒属于正粘病毒科，包含 4 个属，分别是α流/感病毒属、β流/感病毒属、γ流/感病毒属和δ流/感病
毒属，其中每个属只包括 1 种类型，分别为甲型流/感病毒、乙型流/感病毒、丙型流/感病毒和丁型流/感病毒。甲型流/感病毒是所有类型流/感病毒中 攻击性和 关注的病毒，其宿主范围最广，感染造成的发/病/率和死亡率 ，并且可以引发严重的呼/吸/道疾病，是季节性流/感和以往所有流/感大流行的元凶。乙型流/感病毒感染可引起轻度至重度呼/吸/道疾病，也会造成季节性流/感，但通常 于人类。一般情况下丙型流/感病毒感染只引起轻微的呼/吸/道/症/状。丁型流/感病毒是继甲型、乙型和丙型流/感病毒之后的一种新型正黏病毒，利用牛作为其自然宿主和扩增宿主，并定期扩散到其他哺乳动物物种，包括猪、马、羊和骆驼等。因此，丁型流/感病毒具有广泛的地域分布和宽泛的宿主范围。丁型流/感病毒感染可导致牛患轻度至中度呼/吸/道疾病，被认为是牛呼/吸/系/统/疾/病综合征的重要关联因子。血清学证据表明，丁型流/感病毒具有感染人的潜在风险。IDV 的存在会使得动物机体抵/抗/力下降,进而引起其他病,毒或细菌的感染,给养殖业带来巨大损失,因此,对 IDV 的预防非常重要。
本试剂盒适用于检测拭子样品、气管、肺、脑、肠（包括内容物）、肝、脾、肾、心等组织脏器中丁型流/感病毒 RNA，适用于丁型流/感病毒感染的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。
【检验原理】
本试剂盒针对丁型流/感病毒高度保守区域设计特异性引物和探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对丁型流/感病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临/床/上对可疑感染病料的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 25T/盒 50T/盒
IDV 反应液 500μL×1 管 500μL×2 管
酶液 25μL×1 管 50μL×1 管
IDV 阳性质控品 50μL×1 管 50μL×1 管
阴性质控品 250μL×1 管 250μL×1 管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
拭子样品：取鼻拭子，将棉拭子深入鼻腔旋转,取鼻腔分泌液;将采样后的拭子分别放入盛有 1.0mLPBS 的
1.5mL 离心管中,加盖、编号。
病死畜采集肺脏或气管分泌物等，用无菌摄子和剪刀采集肺脏等,装入一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号。
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
拭子样品：样品在混合器上充分混合后,用高压灭菌摄子将拭子中的液体挤出,弃去拭子,室温静置 30 min,4 ℃、3000 r/min 离心 15 min,取上清液转入无菌的 1.5mL 离心管中,编号备用；组织样品：将所采组织病料置于洁净、灭菌并烘干的研磨器中,按质量体积比(1:1)加入样品保存液进行充分研磨;4  ℃、3000 r/min 离心 15 min,取上清液转人无菌的 1.5mL 离心管中,编号备用。
1.2 核酸提取
推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 IDV 反应液 酶液
用量 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM，淬灭通道
（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1cycle 50℃ 10min 否
2 1cycle 95℃ 2min 否
3 45cycles 95℃ 15sec 否
60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI 7500 仪器为例）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。