【产品名称】
商品名称：口蹄疫病毒亚洲 1 型（FMDV-Asia1）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）
Name ：Foot-and-mouth Disease Virus Type Asia I Detection Kit（Real-Time PCR Method）
【包装规格】25T/盒、50T/盒
【预期用途】
口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）感染引起偶蹄动物的一种急性、烈性、接触性传染病。 动物卫生组织（OIE）将口蹄疫列为必须报告的动物传染   病，我国规定口蹄疫为一类动物疫病。
口蹄疫的传染源主要为潜伏期感染及临床发/病动物。易感动物可通过呼/吸/道、消/化/道、生殖道和伤/口/感/染病毒，通常以直接或间接接触（飞沫等）方式传播，或通过人或犬、蝇、蝉、等动物媒介。感染动物呼出物、唾液、粪便、尿液、乳、精液及肉和副产品均可带毒。牛羊等反刍动物感染后，病毒可在食道-咽喉部持续带毒[1]。该病可分为 O、A、C、南非 I 型、南非 II 型、南 III 型和亚洲 I 型等血清型，我国口蹄疫以 O 型、A 型为主，亚洲 1 型也有分布，其产生的危害不容忽视。
本试剂盒适用于检测口蹄疫易感动物的水泡液、水泡皮、组织样品、反刍动物 O-P 液样品及血清样品中亚洲 1 型口蹄疫病毒，适用于亚洲 1 型口蹄疫病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒用对亚洲 1 型口蹄疫病毒设计特异性引物探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对亚洲 1 型口蹄疫病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临/床/上对可疑感染病料的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 25T/盒 50T/盒
FMDV-Asia1 反应液 500μL×1 管 500μL×2 管
酶液 25μL×1 管 50μL×1 管
FMDV-Asia1 阳性质控品 50μL ×1 管 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管 250μL ×1 管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【样品采集】
水泡液采集：典型临床发/病动物水泡液用灭菌注射器吸出后装入样品保存管，加青霉素 1000 IU/mL、链霉素 500 IU/ mL，加盖封口，冷冻保存。
其它样品采集参考 GB/T 18935-2018《口蹄疫诊断技术》[1]中（5.3.2 章节）水泡皮样品采集，（5.3.3 章节）组织样品采集、（5.3.4 章节）反刍动物 O-P 液样品采集、（5.3.5 章节）血清样品采集进行规范采集。
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。
【使用方法】
1. 样品处理（样品处理区）
1.1 样品前处理
水泡液样品：水泡液以 3000 r/ min 离心 10 min，取上清液备用。
水泡皮样品处理，组织样品处理、反刍动物 O-P 液样品处理，血清样品处理参考 GB/T18935-2018《口蹄疫诊断技术》[1]进行规范处理。
1.2 核酸提取
推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，   请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样品总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样品数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：
试剂 FMDV-Asia1 反应液 酶液
用量 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样品处理区）
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；
荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 50℃ 10min 否
2 1 cycle 95℃ 2min 否
3 45 cycles 95℃ 15sec 否
60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期， 阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样品检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样品检测结果与样品收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样品提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
4. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
5. 样品处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
6. 实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；
7. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1] 国家市场监督管理总局. GB/T 18935-2018 口蹄疫诊断技术[S].