【产品名称】
商品名称：乙型流/感病毒 Victoria 系/Yamagata 系（Bv/By）核酸检测试剂盒（双重荧光 PCR 法）
Name ： Influenza B virus Victoria series/Yamagata series (Bv/By) nucleic acid detection kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
本试剂盒适用于检测鼻咽拭子、气管分泌物等标本中的乙型流/感病毒 Victoria 系/Yamagata 系（Bv/By）的
RNA，适用于乙型流/感病毒 Victoria 系/Yamagata 系（Bv/By）的感染的辅助诊断及流行病学调查。
【检验原理】
本试剂盒根据乙型流/感病毒 Victoria 系/Yamagata 系（Bv/By）的基因分别设计的特异性引物和荧光探针， 用一步法荧光 RT-PCR 技术对乙型流/感病毒 Victoria 系/Yamagata 系（Bv/By）进行体外扩增检测，用于临/床/上对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 50T
Bv/By 反应液 500μL×2 管
酶液 50μL×1 管
Bv/By 阳性质控品 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管
注：
1） 不同批号试剂不能混用。
2） 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 9 个月。
【适用仪器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
患病动物：鼻咽咽拭子、气管分泌物；血液：用一次性无菌注射器抽取静/脉血 2mL。
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
鼻咽棉拭、气管分泌物取 100μl。血液样品，3000rpm 离心 5min，吸取 100μL 上层血清，转移至 1.5mL 灭菌离心管
1.2 核酸提取
推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按 照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 Bv/By 反应液 酶液
用量 20μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM、VIC、淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.2 质控标准
阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
5.3 结果判断
CT 值
结果判定
乙型流/感病毒
Victoria 系（VIC） 乙型流/感病毒
Yamagata 系
（FAM）
≤35 >38 Bv 阳性
>38 ≤35 By 阳性
>38 >38 Bv/By 均为阴性
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
