【产品名称】
商品名称：对虾黄头病病毒(YHV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)
Name ：Yellow Head Disease Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
虾黄头病（YHD）是由虾黄头病毒（Yellow Head Virus, YHV）引起的严重威胁虾养殖的疫病，其感染广发、致死率高，是 OIE 规定的需上报的水生动物疫病。目前仅有斑节对虾和南美白对虾有大规模 YHD 报道，但日本对虾、白对虾、南极磷虾等也能自然感染 YHV。YHV 属于黄头症候群病毒，目前该群病毒有 6 个已知的基因型，YHV 是黄头病的 病原。YHD 爆发时，患病虾停止摄食，集聚于池边或水表游动，濒死虾外表发白，头胸甲因肝胰/腺变黄呈现黄色[1]。
本试剂盒适用于检测的对虾样品等标本中对虾黄头病病毒 RNA，适用于对虾黄头病病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒对对虾黄头病病毒基因设计特异性引物探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对对虾黄头病病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临/床/上对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
名 称 规 格
酶液 50μL×1 管
YHV 反应液 500μL×2 管
YHV 阳性质控品 50μL×1 管
阴性质控品 250μL×1 管
注：
1） 不同批号试剂不能混用。
2） 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列
荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
对虾样品按不同的大小或感染期取不同组织样品 0.1g 左右，其中，对虾幼体、
仔虾取完整个体，3cm 以下的幼虾取摘除虾眼的头胸部，较大的幼虾可取腮区或数根腮丝，成虾取 1~2 根腮丝或自心/脏或腹部血窦抽取血/淋巴，怀疑为慢性感染的较大幼虾或成虾取淋巴器官。如果 2h 以后才能处理，宜将样本保存于无/水/乙/醇中。非对虾的甲/壳类动物参照对虾的方法取样。非生物样品，取 0.1~0.5g。
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标
本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
手/术/剪剪碎混匀后取 0.05g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨， 待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL灭菌离心管中。
1.2 RNA 提取
推荐采用公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），
请按照试剂盒说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 YHV 反应液 酶液
用量 20μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。
3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：
检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是

5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道 35
≤38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性； 阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
6. 质控标准
阴性质控品：Ct 值>38 或无 Ct 值；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7. 检测方法的局限性
7.1 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
7.2样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
7.3阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
7.4病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
7.5不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
7.6试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.7本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。

【注意事项】
1.所有操作严格按照说明书进行；
2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.反应液应避光保存；
4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全   通则》进行处理。
【参考文献】
[1]陈爱平, 江育林, 钱冬, 等. 水生动物疫病病种介绍之:黄头病[J].中国水产, 2011. [2]国家质量监督检验检疫总局. SN/T 1151.4-2011 虾黄头病检疫技术规范[S]. 北京：科学出版社, 2011.
[3]杨昊霖. 对虾白斑综合征病毒和黄头病毒等温扩增检测方法的建立及应用[J]. 上海海洋大学, 2013.