【产品名称】
通用名称：鹿源性成分(Deer)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)
Name ：Diagnostic Kit for Deer derived ingredients DNA (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
本试剂盒适用于动物组织以及食品、饲料等样本中鹿源性成分的检测。检测结   果仅供参考。
【检验原理】
本试剂盒用 SB/T 10923-2012 中的鹿源性成分特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对核酸进行体外扩增检测，从而达到快速检测之目的。
【试剂组成】
名 称 规 格
酶液 50μL×1 管
Deer 反应液 500μL×2 管
Deer 阳性质控品 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次。有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
取动物组织及其制品、食品或饲料约 1g，转至含 1.5mL 无菌生理盐水的洁净离心管送检。
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。但不能超过 6 个月，标本运送应采用 0℃冰/壶。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 参照 SN/T2980-2011 标准的提取方法，如下：
1.1.1 试剂配置
1) 1mol/L Tris-Cl（pH8.0）：称取 Tris 121.1g，加入 ddH2O 800mL 溶解，冷却至室温后弄 3M 浓盐酸调 PH 至 8.0，加 ddH2O 定容至 1L，分装灭菌。
2) CTAB 裂解液：800mLddH2O 加入 40.95g NaCl，10g CTAB（十六烷基三甲/基溴化铵）；完全溶解后加入 1mol/L Tris-Cl（pH8.0）50mL，0.5mol/L EDTA
（pH8.0）20mL，磁力搅拌器剧烈搅动拌用氢氧化钠调节 pH 至 8.0，水定容至1L，分装灭菌；
1.1.2 DNA 提取
取 100mg 左右样品于 1.5mL 离心管中，加入 600-800μL 预冷的 CTAB 裂解液， 65℃水浴 30min，每隔 10min，振荡混匀一次；100℃沸水浴 5min；12000r/min离心 5min，吸取上清液至一新的离心管中，加 400μL 氯仿+异戊醇混合液（体积比 24：1），充分混匀后 12000r/min 离心 10min，吸取上清液至新的离心管中，加0.8 倍体积的异丙/醇，-20℃下沉淀DNA 30min；12000r/min 离心10min，弃去上清液；75%乙/醇轻柔地洗涤沉淀一次，12000r/min 离心 8min，弃液体， 晾干；加入 100μL 1xTE，充分溶解沉淀;
1.2 核酸稀释（油脂类饲料不必进行此步骤）
提取的 DNA 用紫外分光光度计进行浓度测定，取 5μL 提取好的 DNA，1mL ddH2O，用 ddH2O 做对照，测定 260nm 和 280nm 的吸光度 A260 和 A280，DNA 的浓度 c=A260x10μg/μL（当 A260/A280 比值在 1.7~1.9 之间时，DNA 模版纯度适宜扩增）。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 Deer 反应液 酶液
用量 20μL 1μL
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；荧光通道选择： 检测通道
（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，请勿选择ROX 参比荧光。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 95℃ 10min 否
2 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.2 判断
a) 检测通道 Ct 值≤30，有 FAM 荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，判断样品为阳性。
b) 当 30
6. 质控标准
a) 空白对照：无FAM 荧光信号检出或 Ct 值≥35，未出现典型的扩增曲线。
b) 阴性对照：无FAM 荧光信号检出或 Ct 值≥35，未出现典型的扩增曲线。
c) 阳性对照：有 FAM 荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ct 值＜30。
d) 以上应同时满足，否则本次实验无效。
7. 检测方法的局限性
7.1样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
7.2样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
7.3阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
7.4病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
7.5不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
7.6试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.7本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1.所有操作严格按照说明书进行；检验过程中，参照《GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测》的规定进行。
2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，混匀并短暂离心；
3.反应液应避光保存；
4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全   通则》进行处理。