◆ 产品说明
十足目虹彩病毒 1（DIV1）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

动物疫病检测系列可针对动物组织、饲料、粪便等样品中病原的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增

曲线判定结果。本产品用于十足目虹彩病毒 1（DIV1）的检测，检出限为 101 copies/μL 基因组 DNA。

◆ 产品组成（48 测试）
试剂 含量
A-DIV1-P 20μL × 8 管× 6 排
NG-P
PG-DIV1-P 100μL × 2 支
100μL × 1 支

◆ 适用仪器
Gentier 32R、Gentier 48E/48R、Gentier mini、CFX 96等实时荧光PCR仪。

◆ 自备耗材和仪器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴；
⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑦电子天平。
◆ 注意事项
1. 本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1） 区：样本制备区。
2） 区：模板添加区。
3） 第三区：扩增及产物分析区。
★ 分区之间 进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2. 实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3. 严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4. 反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心 30
秒。
5. 反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶/胶污染，禁止开盖。
6. 不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
①样品的采集和制备是十足目虹彩病毒 1 检测的重要步骤，为防止交叉污染，应使用一次性消耗品，研钵应经160℃干烤 2 h，其他不宜干烤或高压处理的器皿应使用 1%次/氯/酸/钠溶液浸泡。②优先采集有症/状的或活力差的个体。取样应尽量采取心/脏、肌肉、皮下组织、鳃、肝胰/腺等组织，活力差的个体采集 10-20 尾/池，活力好的个体至
少多点采集 150 尾/池后混匀再随机抽检 10-20 尾。对于幼虾、仔虾、幼体或受精卵取整体，活力差的个体至少采集
20 尾/池，活力好的虾苗至少采集 150 尾/池。同一批样品，建议多点采集合并后，作为一份样品进行均质，提取 DNA。
③采样过程应快速完成，将采取的样品放入无菌均质袋中均质成糜状，充分混匀。  请参照相关标准进行样品前处理。
◆ 实验操作
1. 模板制备（样本制备区）
建议使用水生动物病原体基因组DNA/RNA提取试剂盒（FAST）等商品化试剂盒，具体过程详见产品说明书。2. 添加模板（模板添加区，放置于冰盒上进行）
剪下所需测试数的已含有反应液的 PCR 管，放置在室温待解冻后，离心 30 秒后打开管盖，向每管反应液中分别加入 5μL 模板，顺序为 NG、待测样品模板、PG-DIV1-P。盖好管盖后，涡旋混匀 30 秒，离心 1min，立即进行PCR 扩增反应。
3. 扩增反应（扩增及产物分析区）
使用荧光定量 PCR 仪，荧光基团选择 FAM，淬灭基团选择 NONE。按下列条件设置扩增反应：

PCR 循环 荧光收集位点
去污染 50℃ 5 分钟 1 个循环 —
预变性 95℃ 5 分钟 1 个循环 —

扩增 95℃ 15 秒
45 个循环 —
60℃ 30 秒 ※

其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
4. 基线和阈值设定
基线调整取 3-15 个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的 点。
◆ 结果判定
测试样品检测 Ct 值≥45 或无 Ct 值，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可判定样品不含有十足目虹彩病毒 1（DIV1）或含量低于检出限；
测试样品检测 Ct 值≤40，曲线呈“S”型扩增曲线，可判定样品含有十足目虹彩病毒 1（DIV1）；
测试样品检测 Ct 值在 40～45 之间，应调整模板浓度，重做实时荧光 PCR。再次扩增后的样品检测 Ct 值＜45， 则可判定样品含有十足目虹彩病毒 1（DIV1）；再次扩增后的样品检测 Ct 值≥45，则可判定该样品不含有十足目虹彩病毒 1（DIV1）或含量低于检出限。
★ NG 反应为平滑直线，PG 反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。