非洲猪瘟病毒荧光定量PCR 试剂盒
ASFC qPCR Kit（Dye based）

产品及特点：
非洲猪瘟(African Swine Fever、ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus、ASFV) 引起猪的一种急性、热性、高度接触传/染/性疾病，病死率几乎高达 ， ASF 最近在我国爆发，给我国养猪业造成重大损失，因此 ASFV 的快速准确鉴定对该病的预/防/和/检/疫/有/着/重/要/作/用，为此本公司开发了简单快捷的 ASFV 染料法荧光定量 PCR 检测试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2. 根据 ASFV 的保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分：
成分 十孔盒包装（去纸托）
2×qPCR MagicMix 500 μL（装 A 袋）
微量核酸稀释液
（荧光 PCR 专用） 1 mL（装 A 袋）
非洲猪瘟病毒 PCR 引物混合物 100 μL（装 A 袋）
非洲猪瘟病毒基因阳性对照
(1×10E8 copy/μL) 50 μL（装 B 袋）
DNA 病毒裂解液试用装 15 次（9 mL）
使用手册 1 份

运输及保存：
低温运输、-20℃保存(A 袋试剂放样品准备区、B 袋的阳性对照 分开放置)，有效期 一年。

自备试剂：
DNA模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

使用方法：
一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装（一管式病毒 DNAout 的成分）。

二、稀释阳性对照
（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成 分）。为增加产品稳定性和避免扩散传/染/性-病原，本产品不提供活体样品做阳性对照， 只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液（ 用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 换枪头，在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中，得 1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
8. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

三、设置 qPCR 反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9. 在 PCR 管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子 储存好后 加）：
成分 样品 阴性对照 阳性对照（2-7 管）
2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL
引物混合物 2 μL 2 μL 各 2 μL
自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL
待测样品 DNA 模板 6 μL 不加 不加
阳性对照（2-7 号） 不加 不加 各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪 器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

10. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 分钟
PCR 反应 （30 个循环）	94℃	60 秒
	50℃	60 秒
	72℃	60 秒

11. 数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时， 吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的 吸收光谱在 500 nm， 发射光 谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

三、数据处理

12. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。