传/染/性胸膜肺/炎放线杆菌(APP)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)

【产品名称】
通用名称：传/染/性胸膜肺/炎放线杆菌(APP)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)
Name  ：Actinobacillus pleuropneumoniae Detection Kit
（Real-Time PCR Method）

【包装规格】50T/盒

【预期用途】
猪传/染/性胸膜肺/炎是由胸膜肺/炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的一种以急性胸膜肺/炎为特征的猪的呼/吸/道传染病。病理特征是纤维性胸膜肺/炎和出血坏死性肺/炎。该病多以最急性型发生，并很快引起猪的死亡，慢性型的导致生/长/缓/慢，成为僵猪，降低饲料报酬，造成很大经济损失[1]。荧光PCR技术法因其简便、快捷、灵敏度高、特异性强成为APP检测的主要手段之一[2-3]。
本试剂盒适用于检测气管分泌物拭子、肺组织等样本中的传/染/性胸膜肺/炎放线杆菌，用于传/染/性胸膜肺/炎放线杆菌感染的辅助诊断。

【检验原理】
本试剂盒采对传/染/性胸膜肺/炎放线杆菌基因保守区设计特异性引物探针，用荧光PCR技术对传/染/性胸膜肺/炎放线杆菌的核酸进行体外扩增检测，用于临/床/上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】
名      称 规      格
酶液 50μL×1管
APP反应液 500μl×2管
APP阳性质控品 50μL×1管
阴性质控品 250μL×1管
注：
1）不同批号试剂不能混用。
2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

【适用仪器】
ABI 、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】
病死或扑杀猪，无菌采集肺病/变部位或病/变/非病/变部位交界处的样品；生猪灭菌棉拭子沾取气管分泌物，放入无菌试管中

【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手/术/剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中

1.2 DNA提取
1) DNA的提取也可以采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的DNA提取试剂盒（离心柱提取法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 APP反应液 酶液
用量（样本数为N） 20μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中，21uL/管。

3. 加样（样本处理区）
将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；
荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列仪器请勿选择ROX参比荧光，选择None即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 95℃ 10min 否
2 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是

5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2 结果判断
阳性：检测通道Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道35 阴性：样本检测结果Ct值>38或无Ct值。

6. 质控标准
阴性质控品：Ct值>38或无Ct值；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤32；
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7. 检测方法的局限性
? 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
? 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
? 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
? 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
? 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
? 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
? 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。


【注意事项】
? 所有操作严格按照说明书进行；
? 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
? 反应液应避光保存；
? 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
? 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
? 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
? 实验完毕后用10%次氯/酸或75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；
? 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】
[1] 张朝阳, 刘二龙. 猪传/染/性胸膜肺/炎研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2006.
[2] 王海丽, 葛长城, 徐公义, 等. 猪传/染/性胸膜肺/炎PCR诊断方法的建立与应用[J]. 中国畜牧兽医, 2009.
[3] Gram T, Ahren P, Andreasen M, et al. An Actinobacillus pleuropneumoniae PCR typing system based on the apx and omlA genes- evaluation of isolates from lungs and tonsils of pigs[J]. Vet Microbiol, 2000, 75(1):43-57.