【产品名称】
商品名称：甲型流/感病毒（IAV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）
Name ：Avian Influenza Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
甲型流/感是由甲型流/感病毒(AIV)引起的一种禽类传染病，鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽均可感染，发/病情况差别较大，有的出现急性死亡，有的无症/状带毒。水禽是 AIV 的自然宿主，也是流/感病毒的天然基因库，几乎所有亚型的流/感病毒都可以在水禽中分离到[1]。在 范围内，家禽中流行的主要有 H5、H6、H7、H9 等亚型。H5 和 H7 亚型的某些毒株可以造成禽类很高的发/病/率和死亡率，被称为高致病性甲型流/感(HPAI)病毒。OIE 将高致病性甲型流/感列为 A 类动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病[2-3]。
本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理，检测甲型流/感病毒，对甲型流/感诊断有重要指导意义。
【检验原理】
本试剂盒针对甲型流/感病毒 M 基因高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含甲型流/感病毒基因组模板的情况下，PCR 反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。
【试剂组成】
包装规格 50T/盒
IAV 反应液 500μL×2 管
酶液 50μL×1 管
IAV 阳性质控品 50μL ×1 管
阴性质控品 250μL ×1 管
注：1）不同批号试剂不能混用。
2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
病死或扑杀动物，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活动物，用棉拭子取呼/吸/道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘/油生理盐水中。
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手/术/剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
1.2 核酸提取
推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取试剂（离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书    进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 IAV 反应液 酶液
用量 19μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：
检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光， 选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1cycle 50℃ 10min 否
2 1 cycle 95℃ 2min 否
3 45 cycles 95℃ 15sec 否
60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6. 检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症/状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯/酸或 75%酒/精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1] Webster R G, Bean W J, Gorman O T, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses [J]. Microbiological Reviews, 1992, 56(1): 152-179.
[2] Shortridge K. Avian influenza A viruses of southern China and Hong Kong: ecological aspects and implications for man [J]. Bulletin of the World Health Organization, 1982, 60(1): 129.
[3] 张烨, 舒跃龙. 2004–2012 年我国甲型流/感流行情况 [J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2013, 27(3): 239-240.